Afinitetna kromatografija v medicini: značilnosti in uporaba

Kromatografija je metoda za ločevanje snovi. uporablja se za naknadno kvalitativno in kvantitativno analizo fizikalnih in kemijskih lastnosti mikrodelcev. Različica te tehnike je afinitetna kromatografija. Zamisel o razlikovanju beljakovinskih spojin s pomočjo afinitetne lastnosti molekul je v znanosti znana že več desetletij. Vendar se je razvil šele v zadnjih letih, po uvedbi hidrofilnih matričnih materialov z visokimi porami. Ta metoda omogoča tako analitične (ločevanje in identifikacija) kot preparativne (čiščenje, koncentracija) naloge.

Bistvo

Afinitetna kromatografija (iz latinskega affinis, soroden) temelji na afinitetnih interakcijah, ki pomenijo nastanek zelo specifičnih vezi med ločilno molekulo (ligand ali afinant) in ciljno molekulo. Ti mehanizmi so v naravi zelo razširjeni (povezovanje mediatorjev ali hormonov in receptorjev, protiteles in antigenov, hibridizacija polinukleotidov in druge vrste procesov). V medicini se afinitetna kromatografija praktično uporablja od leta 1951.

Sestavine se ločijo na naslednji način:

• Delovna raztopina, ki vsebuje snov, ki jo je treba ločiti, se pretaka skozi sorbent;
• Snov zadrži ligand, ki je nanesen na matrico sorbenta;
• Koncentracija (kopičenje) snovi;
• ekstrakcija ekstrahirane snovi iz sorbenta z izpiranjem s topilom.

Ta tehnika omogoča izolacijo celih celic. Razlika v primerjavi s tradicionalno sorpcijsko kromatografijo je v tem, da se izolirana komponenta močno biospecifično veže na sorbent, za kar je značilna visoka selektivnost.

Adsorbenti

Naslednje snovi se uporabljajo kot adsorbenti:

• Gelske formulacije na osnovi agaroze, polisaharida, pridobljenega iz agarja. Najpogosteje se uporabljajo tri vrste: sefaroza 4B, CL (navzkrižno vezana agaroza) in afi- gel. Slednja formulacija je modificiran gel iz agaroze in poliakrilamida. Je biološko bolj inertna, kemično in toplotno stabilna.
• Silikagel.
• Steklo.
• Organski polimeri.

Za odpravo mehanskih motenj stika z ligandom se uporabljajo dodatne snovi za ločevanje liganda od nosilca (peptidi, diamini, poliamini, oligosaharidi).

Aparat

Oprema za afinitetno kromatografijo vključuje naslednje glavne komponente

• Rezervoarji za shranjevanje mobilne faze (eluenta);
• visokotlačne črpalke za hranjenje Mediji (najpogosteje batni);
• Filter za odpraševanje eluentov;
• Naprava za doziranje;
• Kromatografska kolona za ločevanje zmesi;
• Detektor za določanje ločenih sestavin, ki zapustijo kolono;
• zapisovalniki kromatogramov in mikroprocesorska enota (računalnik).

Da bi zmanjšali količino raztopljenega zraka, skozi mobilno fazo najprej spustimo helij. Za spreminjanje koncentracije eluenta se uporablja več črpalk, ki jih upravlja programator. kromatografske kolone iz nerjavnega jekla (kjer so zahteve glede odpornosti proti koroziji višje), stekla (univerzalna različica) ali akrila. Za preparativne namene imajo lahko premer od 2 do 70 cm. Mikrokolone Ø10-150 µm se uporabljajo v analitični kromatografiji.

Da bi povečali občutljivost detektorjev, se zmesi dodajo reagenti, iz katerih nastanejo snovi, ki bolj absorbirajo svetlobo v ultravijoličnem ali vidnem delu spektra.

Metodologija

Razlikujemo med dvema osnovnima vrstama tekočinske afinitetne kromatografije:

• Kolonski, pri katerem je kolona napolnjena s stacionarno fazo, zmes pa skozi njo prehaja s tokom eluenta. Ločevanje lahko poteka pod pritiskom ali zaradi gravitacije.
• Tanka plast. Eluent se prenaša s kapilarnimi silami preko ravne adsorbcijske postelje. Adsorbent se nanese na stekleno ploščo, keramično ali kremenčevo palico ali kovinsko folijo.

Glavna stran delovni koraki vključujejo:

• Priprava adsorbenta, fiksiranje liganda na nosilcu;
• Napajanje zmesi za ločevanje v kromatografsko kolono;
• polnjenje mobilne faze, vezava komponente z ligandom
• sprememba faze za sprostitev vezane snovi.

Namen

Afinitetna kromatografija se uporablja za ločevanje naslednjih vrst snovi (v oklepaju je navedena vrsta liganda, ki se uporablja v tem postopku)

• analogi encimskih inhibitorjev, substratov in kofaktorjev (encimov);
• bioorganske snovi z znaki genetske tujosti, virusi in celice (protitelesa);
• visokomolekularni ogljikovi hidrati, monosaharidni polimeri, glikoproteini (lektini);
• Jedrske beljakovine, nukleotidiltransferaze (nukleinske kisline);
• Receptorji, transportni proteini (vitamini, hormoni);
• Beljakovine, ki sodelujejo s celičnimi membranami (celice).

Ta tehnologija se uporablja tudi za proizvodnjo imobiliziranih encimov, njihova vezava na celulozo pa omogoča proizvodnjo imunosorbentov.

Kromatografija beljakovin, ki vežejo DNK

Beljakovine, ki vežejo DNK, se izolirajo s heparinom. Ta glikozaminoglikan lahko veže širok spekter molekul. Afinitetna kromatografija proteinov iz te skupine se uporablja za izolacijo snovi, kot so:

• iniciacijski in elongacijski dejavniki translacije (sinteza molekul nukleinskih kislin in proteinov)
• restriktaze (encimi, ki prepoznavajo specifična zaporedja v dvoverižni DNK)
• DNA ligaze in polimeraze (encimi, ki katalizirajo povezovanje dveh molekul v novo kemično vez in sodelujejo pri replikaciji DNA);
• Zaviralci serinskih proteaz, ki imajo pomembno vlogo v imunskih in vnetnih procesih;
• Rastni dejavniki: fibroblastni, Schwannovi, endotelijski;
• proteini medceličnega matriksa;
• hormonski receptorji;
• lipoproteini.

Prednosti

Ta metoda je ena najbolj specifičnih za izolacijo reaktivnih spojin (encimov in večjih agregatov - virusov). Vendar se ne uporablja le za izolacijo biološko aktivnih snovi.

Odkrivanje protiteles v majhnih količinah, kvantifikacija poliadenilne kisline, ekspresno določanje molekulskih mas dehidrogenaz, odstranjevanje nekaterih kontaminantov, študija kinetike aktivacije neaktivne oblike tripsina, molekulska struktura človeških interferonov - to ni popoln seznam študij, v katerem Afinitetna kromatografija. V kliniki se uporablja zaradi svojih prednosti, kot so:

• Učinkovito čiščenje proteinov, polisaharidov in nukleinskih kislin. Nekoliko se razlikujejo po svojih fizikalnih in kemijskih lastnostih ter so neaktivni pri hidrolizi, denaturaciji in drugih vplivih, ki se uporabljajo pri drugih metodah.
• Hitro ločevanje snovi, dinamična narava procesa.
• Za določitev disociacijskih konstant ni potrebno posebno čiščenje encimov ali homogenizacija izoencimov.
• Možnost ločevanja širokega spektra snovi.
• Majhna poraba liganda.
• Možnost ločevanja snovi v velikih količinah.
• Povratni proces vezave bioloških makromolekul.

Metodo je mogoče kombinirati z drugimi in uporabiti dodatna polja (gravitacijsko, elektromagnetno). To povečuje tehnične možnosti kromatografije.

Encimski inženiring

S to metodo se je aktivno razvilo novo področje biotehnologije - encimski inženiring.

Afinitetna kromatografija, ki se uporablja za izolacijo encimov, ima naslednje prednosti:

• Pridobivanje encimov v večjih količinah zaradi krajšega časa, kar jih naredi cenejše;
• Imobilizacija encimov omogoča znatno razširitev področja njihove uporabe v medicini in industriji;
• povezava encimov z netopnim trdnim substratom omogoča preučevanje vpliva mikrookolja in smeri reakcij, ki imajo pomembno vlogo v naravnih in fizioloških procesih.