Pretočna citofluorimetrija - narava in uporaba

Pretočna citofluorimetrija je citološka raziskovalna metoda, Uporablja se za poglobljeno analizo celic. Njegova prednost je, da lahko preučujemo vsako celico posebej. S to vrsto analize lahko v nekaj sekundah ocenite več parametrov v več sto celicah. Zaradi tega je citofluorimetrija ena od najhitrejših in najnatančnejših preiskav, ki so trenutno na voljo znanstvenikom in klinikom.

Načelo

Načelo metode pretočne citofluorimetrije temelji na merjenju sipanja svetlobe in luminiscence (fluorescence) celic. Celična suspenzija se z veliko hitrostjo pretaka skozi celico citometra, kjer se obseva z laserjem. Pri tem se izvaja tako imenovano hidrodinamično ostrenje. Njegov mehanizem je, da se tok iz celice s preučevanimi delci na izhodu steka v zunanji curek, ki ima večjo hitrost. Rezultat je poravnava delcev v urejeno verigo.

Celice so predhodno označene s posebnimi fluorescenčnimi barvili (fluorohromi). Zaradi njih laserski žarek proizvaja sekundarno luminiscenco. Sprejete svetlobne signale zabeležijo detektorji. Informacije se nato obdelajo s programskimi algoritmi, ki omogočajo štetje posameznih populacij celic, ki se razlikujejo po določenih merilih.

Pri preiskavi z običajnim mikroskopom pogosto ni mogoče razlikovati med različnimi celicami, saj so si vse podobne. S citofluorimetrijo je mogoče pridobiti druge podatke (strukturna integriteta DNK), analiza izražanja beljakovin, preživetje celic.

Ker so za vzbujanje fluorokromov potrebne različne valovne dolžine svetlobe in različne vrste detektorjev, so sodobne naprave opremljene z več detekcijskimi kanali (od 4 do 30). Število laserskih oddajnikov je lahko od 1 do 7. Bolj izpopolnjene naprave omogočajo večparametrično preučevanje več lastnosti delcev hkrati.

Prednosti in slabosti

Prednosti pretočne citofluorimetrije so

• Visoka hitrost obdelave (registracija do 30.000 dogodkov v 1 sekundi);
• Možnost pregleda velikega števila celic (do 100 milijonov). v vzorcu);
• kvantifikacija intenzivnosti fluorescence;
• analizo vsake celice;
• Hkratna analiza heterogenih procesov;
• samodejno ločevanje podatkov po populacijah celic;
• kakovostna vizualizacija rezultatov.

Druga značilnost te tehnologije je, da je delce, ki se analizirajo, mogoče obarvati z več fluorescenčnimi raztopinami. Izvajajo se večparametrične analize.

Slabosti so zapletena tehnična oprema in potreba po posebni pripravi vzorca.

Citometri

Prve tovrstne naprave so se pojavile že leta 1968 v Nemčiji, razširjene pa so postale veliko pozneje. Trenutno lahko vse instrumente za pretočno citometrijo razdelimo na dve vrsti:

• Naprave, ki merijo emisijo fluorescence (dve ali več valovnih dolžin) in sipanje svetlobe pod kotom 10° in 90° (detektor majhnega kota in detektor stranskega sipanja);
• aparati, ki poleg merjenja več parametrov celic samodejno razvrščajo v skupine glede na ta merila.

Detektor za neposredno sipanje svetlobe je namenjen merjenju velikosti celic, medtem ko naprava za stransko sipanje svetlobe zagotavlja informacije o prisotnosti znotrajceličnih peletov, razmerju prostornine citoplazme in jedra.

Klasični citometri v nasprotju s svetlobnimi mikroskopi ne omogočajo slikanja celice. V zadnjih letih so bile razvite kombinirane naprave, ki lahko združujejo zmogljivosti mikroskopa in citofluorimetra. Opisani so v nadaljevanju.

Slikovni citometri

Ena od značilnosti instrumentov, ki se uporabljajo v klasični pretočni citofluorimetriji, je, da v primeru zaznavanja redkih dogodkov v analizirani populaciji celic ni mogoče oceniti narave. Ti delci so lahko ostanki mrtvih celic ali redke skupine celic. V običajnih aparatih so takšni podatki izključeni iz splošnega poteka dogodkov, vendar imajo lahko posebno vrednost za znanstveno in klinično analizo.

Nova generacija pretočnih citometrov omogoča zajem slike vsake celice, ki prehaja skozi detektorsko območje v pretočnem citometru. To si lahko enostavno ogledate s klikom na ustrezno območje diagrama, ki je prikazano na računalniškem monitorju.

Aplikacije

Pretočna citofluorimetrija - univerzalna metoda, ki se uporablja na številnih področjih medicine in znanosti:

• imunologijo;
• onkologija;
• Transplantologija (presaditev rdečega kostnega mozga, presaditev matičnih celic);
• hematologija;
• toksikologija;
• Biokemija (meritve znotrajcelične kislosti, pregled drugih parametrov);
• farmakologija (ustvarjanje novih zdravil);
• mikrobiologija;
• Parazitologija in virologija;
• Oceanologija (preučevanje fitoplanktona za oceno stanja vodnih teles in druge naloge);
• Nanotehnologija in analiza mikrodelcev.

Imunologija

Človeški imunski sistem je sestavljen iz zelo različnih celic. Pretočna citofluorimetrija v imunologiji omogoča oceno njihove strukture in funkcije, tj. morfofunkcionalno analizo.

Takšne študije pomagajo raziskati zapleteno naravo imunosti. Fenotipi celic se spreminjajo zaradi aktivacije antigena, patologije in drugih dejavnikov. S citofluorimetrijo lahko ločimo subpopulacije imunskih celic v kompleksni mešanici in ocenimo vse celične spremembe skozi čas.

Onkologija

Ena najpomembnejših nalog v onkologiji je diferenciacija celičnih tipov. Načelo pretočne citofluorimetrične analize v onkohematologiji temelji na naslednjem pojavu: ko vzorec obdelamo s posebnim fluorescenčnim barvilom, se to veže na citoplazemske beljakovine. Po delitvi se v aktivno razmnožujočih se celicah prepolovi. Intenzivnost luminiscence celic se zato prepolovi.

Obstajajo tudi drugi načini za odkrivanje proliferacijskih celic:

• uporaba barvil, ki vežejo DNK (propidijev jodid);
• uporaba označenega uracila;
• zabeleži povečano raven izražanja ciklinskih beljakovin, ki so vključene v uravnavanje celičnega cikla.